開學(xué)了,ELISA實驗開始咯

    開學(xué)了，過了一個寒假，ELISA實驗操作還記得吧，今天恒遠(yuǎn)生物就帶大家一起來回顧下ELISA實驗的疑難點！

    實驗原理
    ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢

物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

    實驗流程
    夾心法ELISA：

    1.加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90分鐘。提示：加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內(nèi)。

    2.生物素化抗體/抗原：棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中立即加入生物素化抗體/抗原工作液100 μL，混勻，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃孵育1小時。

    3.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機。每一步洗滌充分是實驗的根本。

    4.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。

    5.洗滌：棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，方法同步驟3。

    6.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實際顯色問題酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。

    7.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

    8.讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測程序。

    9.實驗完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。

    競爭法ELISA：

    1.加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔50 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔50 μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。立即每孔加入配好的

生物素化抗體工作液50 μL?；靹颍o酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育45分鐘。提示：加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內(nèi)。

    2.洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機。每一步洗滌充分是實驗的根本。

    3.HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。

    4.洗滌：棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，方法同步驟2。

    5.底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實際顯色酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。

    6.終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

    7.讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測程序。

    8.實驗完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。

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