大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表達(dá)

　大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表達(dá)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展, 基因治療已成為繼腫瘤的手術(shù)治療和放療、化療后的又一新途徑。特別是自殺基因治療為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。大腸桿菌DeoD基因編碼的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能將無毒的前體藥脫氧腺苷類似物分解產(chǎn)生劇毒的腺嘌呤類似物, 通過抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,而引起細(xì)胞死亡。同時(shí)它能夠通過產(chǎn)生*的旁觀者效應(yīng),不僅使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞被殺死,而且大量未轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞亦被殺死[1,2]。本文對大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）基因進(jìn)行分子克隆并構(gòu)建到pcDNA3.1真核表達(dá)載體中, 并獲得穩(wěn)定表達(dá)EPNP基因的MKN45細(xì)胞克隆,為今后進(jìn)一步研究自殺基因在胃癌基因治療中的應(yīng)用創(chuàng)造條件。

　　1  材料和方法

　　1.1  載體與菌株  大腸桿菌JM109和真核表達(dá)載體pcDNA3.1均購自Invitrogen公司?？寺≥d體pMD18T購自大連寶生物公司。

　　1.2  主要試劑  限制性內(nèi)切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA鏈接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均購自大連寶生物公司；凝膠DNA提取Kit和PCR產(chǎn)物純化Kit購自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geneticin（G418 Sulfate） 及MePdR為Invitrogen公司產(chǎn)品；IPTG和Xgal購自上海生物工程公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

　　1.3  目的基因的克隆  ①引物設(shè)計(jì): 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的EPNP基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對引物。為方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分別引入Hind III 和Bam HI 酶切位點(diǎn)。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：TATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大腸桿菌JM109基因組DNA的提取,按文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行。③PCR: 94℃變性5min進(jìn)入循環(huán),94℃,60秒,56℃,60秒,72℃,120秒,經(jīng)30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后72℃延伸10min。取10μl PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定。PCR產(chǎn)物的回收按PCR產(chǎn)物純化Kit上的說明進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物保存于20℃?zhèn)溆谩?/span>

　　1.4  PCR產(chǎn)物的克隆及測序  TA克隆載體pMD18T與膠回收純化的PCR產(chǎn)物按1∶3（摩爾比）的比例在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接, 16℃反應(yīng)16ｈ。取10μｌ連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌,將轉(zhuǎn)化的菌液涂在Xgal 處理過的含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12ｈ,在長出藍(lán)、白克隆的LB平板上挑取白色克隆進(jìn)行少量擴(kuò)增、質(zhì)粒小提, 用酶切初步鑒定陽性細(xì)菌克隆, 將酶切鑒定正確的細(xì)菌克隆送交大連寶生物公司測序。

　　1.5  真核表達(dá)載體pcDNA3.1EPNP的構(gòu)建和鑒定  測序正確的質(zhì)粒pMD18T用限制酶Hind III和Bam HI進(jìn)行雙酶切反應(yīng), 純化回收約716ｂp大小的目的片段; 質(zhì)粒pcDNA3.1也進(jìn)行Hind III和Bam HI雙酶切,純化回收大片段。用T4DNA連接酶連接目的片段和線性化的空質(zhì)粒pcDNA3.1, 16℃反應(yīng)16ｈ。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109,將轉(zhuǎn)化的菌液涂在含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12ｈ,挑取6個(gè)陽性克隆進(jìn)行少量擴(kuò)增、質(zhì)粒小抽,以Hind III和BamHI雙酶切鑒定陽性細(xì)菌克隆。

　　1.6  真核表達(dá)載體pcDNA3.1EPNP的轉(zhuǎn)染  將重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌JM109及以空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)化的菌株,在LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18ｈ,按照質(zhì)粒提取說明分別提取pcDNA3.1EPNP和pcDNA3.1,經(jīng)紫外分光光度儀測定A260nm定量。按照LipofectaminTM Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN45。

　　1.7  RTPCR 鑒定EPNP基因在MKN45細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)  待具有Ｇ418抗性的MKN45細(xì)胞克隆長滿6孔板時(shí),抽提轉(zhuǎn)染pcDNA3.1EPNP細(xì)胞（MKN45/pcDNA3.1EPNP）和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1細(xì)胞（MKN45/pcDNA3.1）總RNA, 進(jìn)行RTPCR反應(yīng), 鑒定EPNP和內(nèi)參照GAPDH mRNA的表達(dá)。

　　1.8  MTT法檢測MePdR對轉(zhuǎn)染ECPNP細(xì)胞的細(xì)胞毒作用  轉(zhuǎn)染pcDNA3.1EPNP細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1細(xì)胞和親本細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，24h后加入不同濃度的MePdR使終濃度分別為107、2.5×107、5×107、106、105mol/L，以不加藥的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對照。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72h后加入MTT 20μl（5μg/ml）,4h后棄上清加入DMSO溶解，震蕩10min后，酶標(biāo)儀測490nm處吸光度（A）值，進(jìn)而按下式計(jì)算各組細(xì)胞存活率：存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%

　　2  結(jié)果

　　2.1  目的基因克隆及測序
   
　　以大腸桿菌基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增出一條約716bp的特異條帶,將純化的PCR產(chǎn)物克隆于載體pMD18T中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌。藍(lán)白篩選,隨機(jī)挑取6個(gè)白色菌落提取質(zhì)粒,用Hind III和BamHI雙酶切后,釋放出716bp左右的片段,見圖1。測序結(jié)果經(jīng)與Genbank中登錄的序列相比較,序列*正確 （本文資料未列出），說明已成功擴(kuò)增了大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的DNA序列。

　 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳（略）

　　M：DNA Marker （DL2000）; 1:pMD18T載體和EPNP基因; 2: PCR 產(chǎn)物

　　2.2  重組表達(dá)載體pcDNA3.1EPNP的構(gòu)建和酶切鑒定
    重組質(zhì)粒用限制酶Hind III和BamHI雙酶切,電泳結(jié)果顯示約716bp處有一特異條帶,證明目的基因已正確插入質(zhì)粒pcDNA3.1,得到了真核表達(dá)載體pcDNA3.1ECPNP，。

　重組質(zhì)粒HindIII 和BamHI 雙酶切鑒（略）

　　M：DNA Marker （DL2000）; 1:pcDNA3.1; 2: EPNP基因; 3: 重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP雙酶切

　　2.3  RTPCR鑒定EPNP基因在MKN45細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)
   
　　重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP轉(zhuǎn)染后經(jīng)Ｇ418（500μg/ml）篩選得到Ｇ418抗性細(xì)胞克隆,抽提細(xì)胞總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng), 采用特異性擴(kuò)增EPNP基因的上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng),得到了EPNP基因的目的條帶（716bp）,提示Ｇ418抗性細(xì)胞克隆中存在ECPNP基因。空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后獲得的Ｇ418抗性細(xì)胞克隆經(jīng)RTPCR后無特異性條帶生成，。

　　圖3  RTPCR 鑒定pcDNA3.1ECPNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞情況（略）

　　1: MKN45/pcDNA3.1;  2、3: MKN45/pcDNA3.1EPNP ; M: DNA Marker （DL2000）

　　2.4  MePdR對轉(zhuǎn)染EPNP細(xì)胞的殺傷作用
   
　　用不同濃度的MePdR處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞存活率。處理72h后，許多轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/EPNP細(xì)胞脫離了培養(yǎng)皿并且出現(xiàn)“收縮”現(xiàn)象，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞仍然吸附在培養(yǎng)皿上未出現(xiàn)任何明顯的細(xì)胞毒跡象，各種細(xì)胞存活率，見表4。很明顯，MePdR并沒有影響親本細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞的存活率，相反，MePdR對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1EPNP細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒作用。

　　表4  不同終濃度的MePdR（0～105mol/L）（略）

　　3  結(jié)論
   
　　目前常用的自殺基因體系如:HSVTK體系和CD體系只能抑制DNA的復(fù)制,只能殺傷處于分裂期的腫瘤細(xì)胞,而在實(shí)體腫瘤中只有一部分腫瘤細(xì)胞處于分裂期,故對此類腫瘤,其殺傷力受到一定限制[4，5]。而經(jīng)大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）催化分解藥物前體6甲基嘌呤脫氧核糖核苷（MePdR）產(chǎn)生的MeP不但可以抑制DNA的合成,而且可以抑制RNA和蛋白質(zhì)的合成,從多個(gè)環(huán)節(jié)殺傷腫瘤細(xì)胞,不但可以殺傷處于分裂期的瘤細(xì)胞,而且可以殺傷靜止的瘤細(xì)胞,具有強(qiáng)大的殺傷力。另外，MeP可以穿過脂質(zhì)膜, 不需依賴細(xì)胞連接即可到達(dá)鄰近細(xì)胞,將其殺傷,旁觀者效應(yīng)明顯[6,7]。一個(gè)自殺基因體系的旁觀者效應(yīng)越強(qiáng),其療效就越好。HSVTK體系的毒性產(chǎn)物為磷酸化物。不能透過脂質(zhì)膜,只能通過細(xì)胞連接進(jìn)入緊鄰細(xì)胞,故其旁觀者效應(yīng)必須依賴細(xì)胞連接[8]。
   
　　據(jù)elisa試劑盒報(bào)道：

本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的重組質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切圖譜與預(yù)期結(jié)果相符,獲得了約716bp大小的目的條帶。目的基因測序結(jié)果與Genbank中登錄的序列一致。因此,本實(shí)驗(yàn)中克隆的EPNP DNA序列是*正確的。我們在實(shí)驗(yàn)中采用特異性擴(kuò)增EPNP基因的上、下游引物，通過RTPCT反應(yīng)鑒定EPNP基因在轉(zhuǎn)基因MKN45細(xì)胞中的表達(dá),證實(shí)了具有Ｇ418抗性的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1EPNP的MKN45細(xì)胞克隆中有EPNP基因的mRNA水平的表達(dá);同時(shí), 用MTT法檢測前體藥MePdR對EPNP高表達(dá)細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)前體藥MePdR對轉(zhuǎn)染EPNP的MKN45細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。說明EPNP確實(shí)是藥物敏感基因即自殺基因，也證明了這些細(xì)胞中有EPNP基因活性蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中我們成功獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EPNP基因的MKN45細(xì)胞克隆, 為進(jìn)一步研究PNP的生物學(xué)功能以及在胃癌基因治療中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。